Cosa sono
I test genetici sono test atti ad individuare varianti genomiche (nella sequenza del DNA) che possono essere causative di / correlate a / predisponenti a patologie o a quadri clinici definiti o complessi. Diagnosticano varianti genomiche ‘’costituzionali’’, ovvero congenite e presenti nell’individuo in ogni cellula o a mosaico.
Si differenziano dai test genetici oncologici che diagnosticano varianti genomiche ‘’somatiche’’, ovvero presenti solo nelle cellule neoplastiche, sebbene oggi siano ormai emergenti e diagnosticabili varianti costituzionali predisponenti all’insorgenza di neoplasie.

Indicazioni
L’accesso ai test genetici è regolamentato da precisi e ben definiti criteri di appropriatezza atti a garantire indagini mirate e ad ottenere diagnosi in tempi contenuti. Tali criteri sono conformi alle linee guida e a documenti consensuali ufficiali fra le società nazionali delle categorie mediche specialistiche di interesse.

Campioni
Test postnatali: sangue periferico e, raramente, saliva o piccola biopsia cutanea.
Test prenatali: villi coriali, liquido amniotico, sangue periferico materno (contenente DNA fetale circolante), raramente sangue fetale cordonale.
Test preimpianto: blastocisti. Alcuni test genetici sono anche effettuabili su poche cellule dell’embrione ottenuto in vitro con fecondazione assistita, quando ancora è allo stadio precoce di blastocisti. La diagnosi preimpianto è disponibile oggi in caso di familiarità per malattie ereditarie gravi ad insorgenza precoce e non suscettibili al trattamento curativo postnatale, o quando uno dei genitori è portatore sano di una anomalia cromosomica.

Modalità di accesso ai test genetici
La maggior parte dei test genetici viene offerta dal SSN con ticket o gratuitamente se il paziente ha diritto ad una esenzione. Sono esclusi dal SSN solo alcuni test di ultima generazione, disponibili, ad oggi, esclusivamente per ricerca medico/scientifica.
Il Medico di base può prescrivere su impegnativa regionale la prestazione “Visita genetica” o “Prima visita di genetica medica”; non può prescrivere un test genetico.
Tutti i test genetici devono essere prescritti con impegnativa regionale dal Medico Genetista contestualmente alla Visita Genetica o da un Medico Specialista di branca secondo precisi criteri di appropriatezza, onde evitare percorsi diagnostici complessi, non mirati o dispersivi, con conseguente dilatazione del tempo di diagnosi e disorientamento del paziente.

Consenso informato
L’accesso ai test genetici è consentito solo in seguito ad ottenimento di consenso informato firmato dal paziente maggiorenne o da un suo tutore in caso di inabilità del paziente, o da entrambi i genitori in caso di paziente minore.

PRINCIPALI TEST GENETICI

In Italia sono eseguibili tutti i test genetici sotto illustrati.

Esame del cariotipo: consente di analizzare l’intero assetto cromosomico di un individuo, ovvero il cariotipo, costituito da 46 cromosomi nella specie umana. Il cariotipo normale è definito da 23 coppie di cromosomi omologhi, contenenti gli stessi geni e di differente origine parentale; la 23° coppia è costituita da due cromosomi omologhi X nel sesso femminile e da un cromosoma X ed un cromosoma Y nel sesso maschile. Il cariotipo femminile normale è definito dalla formula 46,XX; il cariotipo maschile normale dalla formula 46,XY. Il test consente di individuare anomalie cromosomiche numeriche o strutturali costituzionali frequentemente correlate a quadri clinici alterati. Le anomalie strutturali sbilanciate identificate mediante analisi cromosomica hanno dimensioni maggiori di 10 Mb e comportano perdita o guadagno di variabili porzioni di cromosoma contenenti geni. Le anomalie strutturali bilanciate non comportano perdita o guadagno di tratti cromosomici e sono presenti in soggetti sani, salvo rare eccezioni. L’esame del cariotipo può essere eseguito su sangue periferico in epoca postnatale o in epoca prenatale con prelievo invasivo di villi coriali in 11° – 13° settimana di gravidanza o di liquido amniotico dalla 15° settimana (con rischio di perdita della gravidanza a causa del prelievo pari a 1-1,5% per villocentesi ed a 0,5 % per amniocentesi). L’analisi del cariotipo è eseguibile anche preimpianto.

Test array CGH o Microarray Costituzionale (CMA): consente di identificare anomalie cromosomiche di dimensioni inferiori a 10 Mb e, pertanto, definite criptiche perché non visibili all’analisi del cariotipo. Si tratta di microdelezioni o microduplicazioni cromosomiche definite con il termine CNVs = Variazioni nel Numero di Copie. Le CNVs possono avere un contenuto genico o essere prive di geni, possono essere di origine ‘’de novo’’ o ereditate da un genitore portatore. La patogenicità di una CNV viene valutata tenendone in conto il contenuto genico, l’origine parentale e la frequenza nella popolazione sana e nei soggetti con quadro clinico alterato. Non tutte le varianti sono causative di una patologia, molte hanno significato clinico incerto o sconosciuto (VOUS) e molte hanno significato di predisponenza; esistono anche varianti benigne in quanto particolarmente rappresentate nella popolazione sana e raramente nei casi patologici, e varianti polimorfiche con frequenza maggiore dell’1% nella popolazione generale. Il test può essere eseguito su DNA estratto da sangue periferico in epoca postnatale e su DNA da villi coriali o amniociti in epoca prenatale; è eseguibile anche preimpianto.

Test SNP array (single nucleotide polymorphism): il DNA è costituito da una lunga catena di unità chimiche legate fra loro dette nucleotidi, caratterizzati da 4 tipi diversi di basi azotate: Adenina, Guanina, Citosina e Timina. Lungo il cromosoma sono presenti nucleotidi che possono essere frequentemente differenti nei due cromosomi omologhi: si tratta di nucleotidi altamente polimorfici, o SNPs. Il test SNP array identifica la presenza di regioni con identici SNPs sui due cromosomi omologhi, quindi, individua una perdita di eterozigosi (diversità di sequenza fra i due omologhi). La perdita di eterozigosi può portare a manifestazione di malattie genetiche recessive.

MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification): è un test quantitativo che consente di diagnosticare delezioni o duplicazioni a carico di un singolo gene o interne ad esso. Si esegue in seguito a specifico sospetto diagnostico per geni la cui delezione/duplicazione totale o parziale si correla a specifiche patologie. Il test può essere eseguito su DNA estratto da sangue periferico in epoca postnatale e su DNA da villi coriali o amniociti in epoca prenatale.

FISH (Ibridazione In Situ Fluorescente): consente di identificare CNVs specificatamente correlate ad alcune patologie in presenza di un preciso sospetto diagnostico. La CNV viene identificata direttamente su un preparato cromosomico mediante l’utilizzo di sonde (piccole sequenze di DNA) fluorescenti che si legano esclusivamente e specificatamente alla regione correlata alla patologia sospettata da indagare e si visualizzano sul cromosoma come spot fluorescenti. Questo test darà il risultato solo per la patologia indagata. Il test può essere eseguito anche in epoca prenatale su preparati cromosomici da villi coriali o amniociti. Tutte le varianti identificabili con FISH sono anche diagnosticabili con test CMA.

Test su DNA fetale libero circolante o NIPT (Diagnosi Prenatale Non Invasiva): il test non comporta alcun rischio di perdita della gravidanza in quanto si esegue su plasma materno tramite un semplice prelevo di sangue. Il test si basa sulla quantificazione dei frammenti di DNA fetale circolante nel plasma materno ed è in grado di individuare, con buona affidabilità, le più frequenti anomalie cromosomiche numeriche associate a sindromi, quali trisomia dei cromosomi 21, 13, 18, aneuploidie (variazioni di numero) dei cromosomi sessuali X e Y. Il test offre la possibilità di ricercare anche anomalie cromosomiche criptiche quali e le CNVs associate alle principali sindromi da microdelezione. il test può essere effettuato dalla 11° settimana gestazionale. L’esito positivo richiede una conferma diagnostica preferibilmente su liquido amniotico.

Test di metilazione: si applica in particolari condizioni cliniche suggestive di alcune sindromi e consente di definire la correttezza del pattern di metilazione di alcune regioni cromosomiche. La metilazione è un meccanismo chimico di regolazione dell’espressione genica. In alcune regioni cromosomiche è necessario che sia presente il pattern di metilazione di entrambi i genitori per una corretta regolazione genica: la presenza del solo pattern di metilazione materno o paterno diviene causativa di importanti sindromi quali la S. di Angelman, Prader Willi, Beckwith Wiedeman, Silver Russell.

Test per UPD (Disomia Uniparentale): individua l’origine uniparentale di interi cromosomi o di porzioni cromosomiche. La UPD di alcuni cromosomi o loro regioni interne può portare a insorgenza di patologie recessive. Il test si applica in caso di particolarissimi quadri clinici e successivamente ad esito positivo del test di metilazione o in caso di riscontro di anomalie cromosomiche bilanciate coinvolgenti i cromosomi 7, 11, 14, 15. Richiede anche il campione ematico dei genitori.

Test di sequenziamento genico: i test di sequenziamento genico si avvalgono di tecnologie che consentono la lettura della sequenza nucleotidica di un gene, ovvero della sequenza di basi azotate del DNA che compongono il testo per la costruzione di proteine. La sostituzione/delezione/inserzione anche di una sola base (o nucleotide) costituisce una mutazione puntiforme e può portare ad una modificazione importante dell’intera sequenza, con conseguente produzione di una proteina alterata. Non tutte le varianti portano danni alle proteine o sono causative o correlate a patologie; esistono varianti di significato incerto (VOUS), o benigne o polimorfiche (con frequenza > 1% nella popolazione). Tutte le varianti possono essere de novo o ereditate.

Tecniche di sequenziamento genico:

• • Ricerca di mutazione nota (es familiare): sequenziamento di un breve tratto di gene contenente una variante nota. Il test può essere eseguito su DNA estratto da sangue periferico in epoca postnatale e su DNA da villi coriali o amniociti in epoca prenatale ed è eseguibile anche preimpianto.
  • Sequenziamento Sanger: sequenziamento di un singolo gene.
  • NGS (Next Generation Sequencing): sequenziamento massivo e contemporaneo di molti geni per la ricerca di varianti di sequenza. La tecnica può consentire anche l’individuazione di CNVs. La tecnica NGS viene utilizzata con varie modalità:
    • Pannelli genici (2 – 100 geni) correlati ad una patologia o ad un gruppo di patologie.
    • Esoma clinico: sequenziamento massivo di tutti i geni correlati a patologia (5.000 – 7.000 geni).
    • Esoma completo (WES Whole Exome Sequencing): sequenziamento massivo di tutti i geni con prodotto proteico presenti nel nostro genoma (18.000-22.000 geni). Si esegue solo per ricerca.
    • Genoma completo (WGS Whole Genome Sequencing): sequenziamento massivo dell’intero genoma, ovvero di tutte le sequenze con o senza prodotto proteico. Si esegue solo per ricerca.

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FONTI

Nomenclatore dell’assistenza specialistica ambulatoriale (salute.gov.it)

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TERMINOLOGIA GENETICA

Allele: ciascuna delle due forme alternativa di un gene o di una qualsiasi sequenza sui due cromosomi omologhi.

Amniocentesi: prelievo di liquido amniotico mediante inserzione di ago per via addominale.

Aneuploidia: variazione nel numero di cromosomi.

Anomalia cromosomica: alterazione numerica o di struttura dei cromosomi.

Base azotata: Le basi azotate Adenina, Timina, Citosina e Guanina sono le lettere che, nel gene, compongono il testo per la codifica ed assemblaggio delle proteine.

Blastocisti: stadio evolutivo dell’embrione corrispondente al 5°-7° giorno di sviluppo, dalla fecondazione.

Cariotipo: assetto cromosomico

CNV: variazione nel numero di copie di una regione cromosomica (duplicazione = 3 copie, delezione = 1 copia, assetto bilanciato (normale) = 2 copie)

Cromosoma: singola molecola di DNA avvolta ed assembrata a componenti proteiche di struttura e visibile nelle cellule in divisione come un piccolo corpo (soma) evidenziabile con alcuni specifici coloranti. In ogni cellula con cariotipo normale vi sono 23 coppie di cromosomi uguali fra loro e di diversa origine parentale, detti cromosomi omologhi (46 cromosomi in totale). La 23° coppia è costituita dai cromosomi sessuali X e Y. Il cariotipo normale viene rappresentato con la formula 46,XX nel sesso femminile e 46,XY nel sesso maschile.

Cromosomi omologhi: cromosomi appartenenti ad una medesima coppia, di diversa origine parentale, contenenti alleli uguali o differenti degli stessi geni, agli stessi loci.

Disomia uniparentale: presenza di 2 cromosomi omologhi, o di regioni interne ad essi, di provenienza da uno stesso genitore.

De novo: non ereditato.

DNA: Acido desossiribonucleico. E’ la molecola che costituisce il genoma. Nella specie umana è suddiviso in 46 molecole corrispondenti ai 46 cromosomi. Ha sede nel nucleo della cellula (esiste anche un DNA extranucleo presente in particolari organelli della cellula detti mitocondri).

Esoma: insieme delle parti codificanti del nostro genoma, cioè di tutte le sequenze di DNA con prodotto proteico, costitutive dei geni. Costituisce circa il 2% di tutto il DNA.

Eterozigosi: diversità di sequenza nel DNA fra i 2 cromosomi omologhi o in una regione interna ad essi.

Gene: sequenza di DNA codificante per una proteina. I geni sono contenuti nei cromosomi. I cromosomi omologhi contengono la stessa serie di geni.

Genoma: l’intero DNA costituito sia dalle sequenze codificanti dei geni sia da tutte le sequenze prive di prodotto proteico. Costituisce circa il 98% dell’intero DNA e contiene regioni sia con funzione regolatrice dell’espressione dei geni, sia sequenze spaziatrici silenti.

Liquido amniotico: liquido di riempimento del sacco amniotico, nel quale si sviluppa il feto.

Locus: punto di mappaggio di un gene, di una CNV o di una particolare sequenza di DNA sul cromosoma.

Malattia genetica recessiva: malattia causata da mutazioni patogeni che in entrambi gli alleli di un gene.

Mb: Megabase = unità di misura che indica la lunghezza di segmento cromosomico contenente 1.000.000 di basi (o nucleotidi).

Metilazione: reazione chimica di legame di un gruppo metilico (-CH3) ad una molecola.

Microsatelliti – STR (Short Tandem Repeats): brevi sequenze di pochi nucleotidi, non codificanti e ripetute in tandem un numero N di volte sui cromosomi omologhi. Il numero di ripetizioni può essere uguale o diverso fra i due omologhi (omozigosi o eterozigosi degli alleli STS) ed è trasmissibile e stabilmente mantenuto nelle divisioni cellulari.

Mosaico: compresenza di 2 o più popolazioni cellulari con differente variante genetica, in uno stesso individuo. Può essere presente anche la popolazione cellulare normale.

Nucleotide: unità molecolare del DNA contenente una singola base azotata. Il DNA è una lunghissima catena di nucleotidi legati chimicamente fra loro.

Omozigosi: identità di sequenza nel DNA fra i 2 cromosomi omologhi o in una regione interna ad essi.

Polimorfismo: variante ad elevata frequenza (>1%) nella popolazione.

Sindrome: patologia costituita da un complesso di caratteristiche cliniche associate e ricorrenti.

SNP: singolo nucleotide polimorfico (ad alta frequenza).

Trisomia: triplice copia di cromosomi omologhi.

Variante genetica costituzionale: presente in tutte le cellule dalla nascita.

Variante genetica somatica: insorta in una singola cellula durante la vita di un individuo e trasmessa alle sole cellule da questa originate. E’, pertanto, presente in una limitata popolazione cellulare.

Variante genica: variazione a carico di una singola base azotata nella sequenza di un gene rispetto ad una sequenza standard definita di riferimento, in quanto originaria o altamente conservata in varie specie nell’evoluzione o con maggiore frequenza nella popolazione.

Variante genomica: qualsiasi alterazione nella sequenza del DNA o nel numero di copie di una regione cromosomica. Sono varianti genomiche le anomalie cromosomiche, le CNVs, le mutazioni puntiformi.

Variante o mutazione puntiforme: variazione a carico di una singola base ( o nucleotide) nella sequenza del DNA.

Villi coriali: componente embrionale della placenta.

Villocentesi: prelievo di villi coriali tramite inserzione di ago per via addominale, raramente transvaginale.

VOUS: Variante di incerto significato.